在PCR實(shí)驗(yàn)中，污染是一個(gè)常見且嚴(yán)重的問題，可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。為有效預(yù)防和處理PCR污染，需遵循以下注意事項(xiàng)：

一、實(shí)驗(yàn)分區(qū)與操作流程

合理劃分實(shí)驗(yàn)區(qū)域：將實(shí)驗(yàn)分為標(biāo)本處理區(qū)、PCR反應(yīng)液制備區(qū)、PCR擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)，各區(qū)域應(yīng)有明確的隔離和方向性，避免交叉污染。

單向工作流程：從預(yù)PCR到后PCR，實(shí)行“單向"工作流程，確保在后PCR區(qū)域引入的耗材和防護(hù)裝備不會(huì)未經(jīng)消毒就回到預(yù)PCR區(qū)域。

試劑與樣品分離：PCR試劑、PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或冰箱。

二、試劑與材料準(zhǔn)備

試劑分裝：所有PCR試劑應(yīng)在超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝，使用專用加樣器和吸頭，避免交叉污染。

試劑儲存：實(shí)驗(yàn)室自配的試劑（如去離子水、緩沖液等）在使用前應(yīng)高壓滅菌或過濾除菌。

試劑小量分裝：PCR試劑應(yīng)小量分裝，以減少重復(fù)取樣次數(shù)，并置于-20℃保存。

三、實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

正確佩戴防護(hù)裝備：實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。

避免氣溶膠污染：操作時(shí)應(yīng)勤換手套，進(jìn)出不同區(qū)域或進(jìn)行模板操作后應(yīng)及時(shí)更換手套；開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠。

減少操作污染：在同時(shí)進(jìn)行多個(gè)PCR反應(yīng)時(shí)，應(yīng)制備主反應(yīng)混合液，再分裝至PCR反應(yīng)管，最后添加樣品核酸模板，以減少單個(gè)添加操作繁瑣造成的污染。

使用防濺污染的吸頭：使用防濺污染的移液器吸頭，減少樣本或試劑中的氣溶膠形成

四、污染監(jiān)測與處理

設(shè)立對照實(shí)驗(yàn)：設(shè)立陰陽性對照和空白對照，監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況，選擇合適的對照樣品。

污染識別：使用“無模板對照"（NTC），其中NTC孔包含所有qPCR反應(yīng)組件，但不包含DNA模板。如果在NTC孔中觀察到擴(kuò)增，可能表明反應(yīng)組件中存在污染。

污染處理：若發(fā)生污染，應(yīng)設(shè)立陰陽性對照監(jiān)測污染情況，排除試劑污染后，考慮環(huán)境污染的可能性，通過追蹤實(shí)驗(yàn)查找污染源，必要時(shí)更換實(shí)驗(yàn)場所或重新設(shè)計(jì)引物。

五、實(shí)驗(yàn)室清潔與消毒

定期清潔：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對操作臺面、儀器、實(shí)驗(yàn)用具及環(huán)境進(jìn)行清潔，避免污染。

消毒措施：使用10-15%的漂白溶液（次氯酸鈉）擦拭表面，讓漂白劑作用于表面10至15分鐘后，用去離子水擦拭，最后用70%酒精浸濕的紙巾快速干燥表面。

設(shè)備消毒：定期消毒用于準(zhǔn)備qPCR反應(yīng)的表面和設(shè)備，包括工作臺面、移液器、冰箱/冷凍室把手、離心機(jī)、渦旋器和其他觸點(diǎn)。

六、污染控制技術(shù)

UNG法：使用尿嘧啶糖苷酶（UNG）去除PCR產(chǎn)物中的污染，優(yōu)點(diǎn)是能去除任何來源的污染，且UNG處理可與PCR擴(kuò)增在同一反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行

DNase I法：采用DNase I法處理反應(yīng)液污染，適用于去除污染DNA。

固相捕獲法：利用生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，再用包被鏈霉親和素的固相載體捕獲雜交核酸，從而去除污染

七、其他注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)記錄與驗(yàn)證：堅(jiān)持常規(guī)清潔工作，設(shè)計(jì)陰性對照組，連續(xù)三天陰性對照沒有起跳，則污染得到控制。

人員培訓(xùn)：所有操作人員應(yīng)接受嚴(yán)格培訓(xùn)，確保操作規(guī)范，減少人為污染風(fēng)險(xiǎn)。

通過以上措施，可以有效預(yù)防和處理PCR污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。