一、構(gòu)建方法

載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建

PVRIG過表達(dá)載體：選擇慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（如pCDH、pLenti等），將PVRIG基因的全長(zhǎng)CDS序列克隆至多克隆位點(diǎn)，并引入強(qiáng)啟動(dòng)子（如CMV或EF1α）。

NFAT-Luc2報(bào)告系統(tǒng)：在Jurkat細(xì)胞中整合NFAT響應(yīng)元件驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告基因（如pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro]），用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞活化信號(hào)（如鈣離子通路）。

篩選標(biāo)記：加入抗生素抗性基因（如嘌呤霉素、新霉素）或熒光標(biāo)記（如GFP）用于穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選。

病毒包裝與感染

將重組載體與包裝質(zhì)粒（如psPAX2、pMD2.G）共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集含有慢病毒顆粒的上清。

通過離心感染或Polybrene增強(qiáng)感染效率，將病毒顆粒感染Jurkat-NFAT-Luc2細(xì)胞系。

穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選與驗(yàn)證

qPCR/Western Blot：檢測(cè)PVRIG mRNA及蛋白表達(dá)水平。

流式細(xì)胞術(shù)：若載體含熒光標(biāo)簽（如GFP），可直接檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比例。

抗生素篩選：使用嘌呤霉素（或相應(yīng)抗生素）連續(xù)處理2-3周，篩選出穩(wěn)定整合PVRIG的細(xì)胞株。

表達(dá)驗(yàn)證：

功能驗(yàn)證：通過抗CD3/CD28抗體刺激或鈣離子載體（如離子霉素）激活NFAT通路，檢測(cè)熒光素酶活性（Luciferase Assay）以確認(rèn)報(bào)告系統(tǒng)的響應(yīng)性。

二、科學(xué)意義

研究PVRIG的免疫功能

PVRIG是新興的免疫檢查點(diǎn)分子，與TIGIT/CD96/CD226家族共同調(diào)控T細(xì)胞和NK細(xì)胞功能。通過過表達(dá)模型可解析PVRIG對(duì)T細(xì)胞活化、增殖、細(xì)胞因子分泌（如IL-2、IFN-γ）的抑制或協(xié)同作用。

結(jié)合NFAT報(bào)告系統(tǒng)，可定量分析PVRIG對(duì)TCR信號(hào)通路（如PLCγ-Ca2?-NFAT軸）的影響。

腫瘤免疫治療靶點(diǎn)探索

PVRIG在多種腫瘤（如結(jié)直腸癌、卵巢癌）中高表達(dá)，可能通過介導(dǎo)免疫逃逸促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。穩(wěn)轉(zhuǎn)株可用于高通量篩選靶向PVRIG的抗體或小分子抑制劑，評(píng)估其對(duì)T細(xì)胞抗腫瘤活性的恢復(fù)效果。

與PD-1/CTLA-4抑制劑聯(lián)用時(shí)，可研究PVRIG阻斷劑的協(xié)同效應(yīng)。

構(gòu)建體外免疫微環(huán)境模型

將穩(wěn)轉(zhuǎn)株與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬腫瘤-T細(xì)胞相互作用，通過檢測(cè)熒光素酶信號(hào)動(dòng)態(tài)評(píng)估PVRIG對(duì)T細(xì)胞浸潤(rùn)和殺傷功能的影響。

結(jié)合CRISPR/Cas9敲除技術(shù)，可反向驗(yàn)證PVRIG的上下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

三、技術(shù)難點(diǎn)與優(yōu)化

轉(zhuǎn)染效率提升：Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染難度較高，需優(yōu)化電穿孔參數(shù)（如電壓、脈沖時(shí)間）或改用慢病毒系統(tǒng)。

報(bào)告系統(tǒng)穩(wěn)定性：長(zhǎng)期傳代可能導(dǎo)致NFAT-Luc2信號(hào)衰減，需定期檢測(cè)熒光素酶活性并分選高表達(dá)亞群。

脫靶效應(yīng)控制：需設(shè)置空載體對(duì)照（Vector Control）及未轉(zhuǎn)染野生型細(xì)胞，排除載體或抗生素對(duì)細(xì)胞功能的干擾。

四、應(yīng)用前景

該穩(wěn)轉(zhuǎn)株可廣泛應(yīng)用于：

藥物開發(fā)：篩選靶向PVRIG的免疫治療藥物。

機(jī)制研究：解析PVRIG與DNAM-1/TIGIT等配體的相互作用機(jī)制。

臨床前模型：構(gòu)建人源化小鼠模型，評(píng)估PVRIG抑制劑在體內(nèi)的抗腫瘤效果。

通過這一模型的構(gòu)建，研究者能夠深入探索PVRIG在免疫調(diào)控中的分子機(jī)制，并為開發(fā)基于PVRIG靶點(diǎn)的腫瘤免疫療法提供重要實(shí)驗(yàn)工具和理論依據(jù)。